BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)

产品货号：

YT394

中文名称：

BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H-)

英文名称：

BalbRT II M-MLV reverse transcriptase(RNase H-)

产品规格：

10kU|50kU|200kU

发货周期：

1～3天

产品价格：

询价

本产品是一种经过改造和优化的M-MLV反转录酶，具有正常的依赖于RNA或DNA模板的DNA聚合酶活性，能够以RNA或DNA为模板，在引物存在的情况下进行互补DNA链的合成，即可以进行cDNA(complementary DNA)的第一链合成。M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus)，也称MMLV或M-MuLV。

本产品是最常用的反转录酶之一。
广泛用于获得总RNA或mRNA后cDNA第一条链的合成，后续可以用于PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR,qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建等。BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)还可以通过反转录用于DNA探针的荧光、生物素、地高辛或同位素标记等，也可以通过引物延伸(primer extention)来分析和研究RNA。
本产品无RNase H活性，反转录效率高、产物长度长。
本产品与野生型M-MLV反转录酶相比，无RNase H活性，不能选择性剪切RNA和DNA杂合双链中的RNA，从而有助于高效合成长度更长的cDNA。本产品经测试可以轻松完成长度为8kb及以下基因的反转录(参考图1)，反转录的最大长度可以超过10kb。

图1.使用BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)反转录总RNA后，对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2～8kb的cDNA可以非常高效地被反转录。
本产品热稳定性高。
最适反应温度为42～45℃，但当温度达到50℃时仍具有很高活性，且可获得较高产量的cDNA (图2)。

图2.BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)在不同温度下的反转录效果。用从NIH3T3细胞抽提获得的总RNA 500ng，在20μL的反转录体系中按照图中所示温度进行反转录。反转录完成后取1μL反转录产品进行目的基因的PCR扩增和电泳。
本产品性价比高。
BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)是一种大肠杆菌重组高表达的的反转录酶，由于其表达量非常高，大大提高了本产品的性价比。本反转录酶含有从Moloney Murine Leukemia Virus reverse transcriptase基因克隆的缺失RNase H domain的pol基因，并进行了突变优化以提高其热稳定性、反转录效率和表达量。

组分	10KU	50KU	200KU
BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)	50μL	250μL	1mL
5×Reaction Buffer	300μL	1.2mL	5mL

本产品中M-MLV反转录酶(RNase H^-)的浓度为200U/μl，用于体积为20μL的反转录体系时，每次反应加入1μL即可满足反应所需。

酶储存液

20mM Tris-HCl (pH7.5),300mM NaCl,0.1mM EDTA,1mM DTT,0.01% NP-40 and 50% glycerol。

酶活定义

One unit of the enzyme incorporates 1nmol of dTTP into acid-precipitable material in 10min at 37℃ using poly(A)·oligo(dT)_12-18as template-primer。
活性检测条件：
50mM Tris-HCl(pH8.3),75mM KCl,3mM MgCl₂,10mM DTT,0.5mM [³H]-dTTP and 0.4mM polyA·oligo(dT)_12-18。

质量控制

不含DNA内切酶、外切酶和磷酸酯酶和RNA酶，可以满足常规反转录合成cDNA第一条链等的需要。

失活抑制

80℃孵育10分钟可以导致M-MLV反转录酶(RNase H^-)失活；
EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对M-MLV反转录酶(RNase H^-)有抑制作用。

一、cDNA第一条链的合成

参考如下表格中设置的20μL反转录体系，RNase Inhibitor(CAT#YT530)和dNTP mix(CAT#YT391)

成分		用量
模板（右侧3种任选其中一种）	Total RNA	0.1ng～5μg
	或poly(A) RNA/mRNA	10pg～0.5μg
	或specific RNA	0.01pg～0.5μg
引物（右侧3种任选其中一种）	Oligo(dT)₁₈primer	0.5μg(或100pmol)
	或Random Hexamer primer	0.2μg(或100pmol)
	或gene-specific primer	15-25pmol
DEPC-treated Water		至13.7μL^①
可选步骤：如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构，混匀后微离心以把液体沉降至管底，65℃孵育5min，随后立即置于冰上冷却，以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
5×Reaction Buffer		4μL
RNase Inhibitor (40U/μL)		0.5μL
dNTP Mix(25mM each)		0.8μL^②
BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)		1μL^③
总体积		20μL

① 至13.7μL表示加入DEPC-treated Water至最终体积为13.7μL。
② dNTP浓度不同时使用的体积需作适当调整，此时DEPC-treated Water的用量需适当调整。
③ 如果用基因特异性引物或Oligo(dT)₁₈反转录制备大于5kb的cDNA，则M-MLV反转录酶(RNase H^-)用量宜增加至2μL，以增加产量。

轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体。
如果使用Oligo(dT)₁₈或基因特异性引物，42℃孵育60min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物，先在25℃孵育10min，随后在42℃孵育60min。
注意：对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA，可以50℃孵育60min，以充分利用本产品在50℃时仍有良好的反转录酶活性这一特点，在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
80℃孵育10min以失活BalbRT II M-MLV反转录酶(RNase H^-)并终止反转录反应。
说明：对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶，该方法易导致部分长片断DNA被剪切，此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等，也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时，如果PCR的反应体系为20和50μL，则推荐相应地使用0.8和2μL反转录产物。

二、引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶(RNase H^-)的相关文献资料进行。

常见问题

总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得，而模板的量本身比较低，反转录的量通常还要少于模板量，并且总RNA的反转录产物大小很不均匀，因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
- PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增，看是否可以成功扩增。如果可以成功，则说明PCR扩增体系没有问题，此时通常是目的基因的引物设计欠佳，当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增，则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
- 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带，并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0，则提示总RNA发生了显著的降解，最好能重新制备总RNA样品。
  避免RNA降解的主要方法是，严格进行RNA的相关操作，包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA，以尽量避免RNase污染。
- 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中，残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化，或者进行沉淀、洗涤和再溶解，通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用百奥莱博的BalbZol(CAT#YT526)或Trizol(CAT#YT527)抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
- 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后，在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化，以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时，需要加入EDTA至终浓度为2.5mM，否则RNA在没有螯合剂的情况下，在加热过程中容易被水解，从而导致模板量不足。此外，扩增特定基因时，需要先查询该基因的组织分布特点，利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增，通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
- 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA，要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时，需要确保基因特异性引物设计合理正确。
- 如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构，此时可以考虑把反转录温度提高到45～50℃。

产品目录